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                      公司新聞

                      煙草的組織培養技術

                      發布時間:2019-07-01 閱讀:87

                      一、目的與要求
                      1.?驗證“植物細胞全能性”理論?。
                      2.?學習用生長調節劑對植物器官發生的誘導方法。
                      二、?實驗原理
                      植物組織培養是指在無菌條件下,分離、并在培養基中培養離體植物組織(器官或細胞)的技術。植物組織培養的理論依據是植物細胞的全能性,即植物體的每個活細胞都有相同的遺傳組成,在適當條件下具有繁殖出完整植株的能力。植物組織當中原本已經分化的細胞,組織、器官一旦脫離原有的機體環境,成為離體狀態,在適宜的營養和外界條件下,就會表現出細胞的全能性,從已經分化的細胞通過脫分化,成為重新具有分裂能力的胚性細胞,并能再分化重新生長發育成完整的植株。
                      愈傷組織:是指一個離體的細胞、一塊組織或一個器官的細胞,通過脫分化不斷分裂、增生子細胞,這些細胞分裂快,結構疏松,顏色淺而透明,逐漸形成了無序結構的細胞團。

                      脫分化:已經分化的細胞,發生生理、生化的改變,退回到胚性細胞的過程。

                      再分化:經過脫分化的細胞或組織再次獲得分化成不同功能的細胞、組織、器官或完整植物體。

                      三、?材料和用具
                      1.?材料:無菌煙草葉盤(已經誘導成芽),擬南芥。
                      2.?用具:超凈工作臺、高壓滅菌鍋、光照培養箱、電子天平、移液器、手術解
                      剖刀、大、小鑷子、30ml燒杯、500ml燒杯、藥勺、玻璃棒、培養瓶、平皿、試紙(PH5.4-7),報紙等。

                      3.?試劑:MS培養基、0.5mol/LNaOH、1mol/L?HCl。

                      四、?操作步驟

                      (一)誘導培養基配制(見表1)
                      1.?加MS儲液(儲液配置見附表)
                      大量元素和微量元素的母液都是高濃度的,為防止混合后發生沉淀,建議加完大量元素后先加水(約總體積3/4),再加各微量元素和有機成分。鐵鹽也是微量元素,因為易發生沉淀,所以與其它微量元素分開配。儲液中的鐵鹽存于棕色瓶中。配好的儲液應當4℃保存。
                      2.?加蔗糖(3%)(m/v)。蔗糖是碳源,同時起到維持滲透壓的作用。?3.?調pH=5.8。pH過低,高溫處里時間過長,都可能會使培養基不凝。?4.?加瓊脂(0.7-0.8%)(m/v)瓊脂粉是固化劑、支持物。
                      (二)滅菌

                      1.?培養基、解剖刀、鑷子、平皿需在高壓滅菌鍋120℃,滅菌15min。

                      2.?接種前打開無菌間和超凈臺紫外燈照射30min。

                      3.?用肥皂洗手和手腕。進入無菌間,先用70%酒精或新潔爾滅噴手。關掉
                      無菌間棚頂紫外燈,打開超凈臺風機,關掉超凈工作臺上的紫外燈。
                      (三)?接種

                      1.?坐在超凈工作臺前,用70%酒精棉球擦拭雙手、培養瓶和超凈臺面。

                      2.?待手上的酒精干了,點燃酒精燈。

                      3.?將培養瓶的蓋子旋松,但不要打開,放到無菌風道側面備用。 將鑷子、解剖刀在酒精燈外焰上灼燒,待其冷卻后,放到培養皿上備用。

                      4.?用鑷子和解剖刀取出一塊葉盤,放到平皿上,切取煙草葉芽1-2塊,插入培養基。 

                      5. 用酒精燈火焰上灼燒瓶口,瓶蓋數秒(阻斷微生物進入),擰上瓶蓋,不必太緊。
                      注意:無菌操作時不要講話,以免污染。用酒精對雙手消毒時,務必待酒精徹底揮發后再靠近酒精燈火焰,以免火焰傷手。進出無菌間關好緩沖間的推拉門。 光照培養箱培養4周,25℃,光照16小時,暗8小時,濕度70%-80%。

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